由米根霉 Rhizopus oryzae Went et Pr. Geerl.引 起的煙葉霉?fàn)€病 (tobacco pole rot) 是煙草烘烤期較 易出現(xiàn)的真菌性病害，主要發(fā)生于煙葉變黃 期，通常在莖基部出現(xiàn)白色菌絲，很快產(chǎn)生黑色 孢子并進(jìn)一步擴(kuò)散為害。在煙葉烘烤過程中，密 集烤房由于空間小、溫度高、濕度大以及空氣流 動快，尤其有利于該病害的發(fā)生與流行。煙葉霉 爛病具有爆發(fā)性和危害性強(qiáng)的特點(diǎn)，嚴(yán)重時發(fā)病 率高達(dá) 100%，常導(dǎo)致烤后煙葉質(zhì)量下降、產(chǎn)量降 低，煙農(nóng)利益受損。

米根霉 Rhizopus oryzae 菌 株 Y5 (CCTCC M 2015720)，貴州省煙草科學(xué)研究 院微生物實(shí)驗(yàn)室提供，采用真菌培養(yǎng)基 (AEA) (酵母粉 5 g/L，KH2PO4 6 g/L，NaNO3 6 g/L，KCl 0.50 g/L，MgSO4 0.25 g/L，甘油 20 mL/L，瓊脂 粉 20 g/L，加去離子水定容至 1 L，滅菌待用) 培 養(yǎng)，于 4 ℃ 下、AEA 培養(yǎng)基斜面上保存。

煙草品種為云煙 87，屬煙草主 栽品種，易感病。于煙葉成熟季節(jié)采集未施用過 任何藥劑的中部成熟葉片，洗凈、晾干后用于活 體防效測定。

85% 代森錳鋅 (mancozeb)，杜邦 中國集團(tuán)有限公司；80% 多菌靈 (carbendazim)， 江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司；96% 嘧霉胺 (pyrimethanil)，江蘇耕耘化工有限公司；98% 嘧 菌酯 (azoxystrobin)，湖北津樂達(dá)化工有限公司； 99.90% 啶酰菌胺 (boscalid)，Sigma-Aldrich 有限公 司；96% 氟啶胺 (fluazinam)，淄博德樽生物科技有 限公司。除代森錳鋅用無菌水、多菌靈用 0.20 mol/L 的稀鹽酸配制外，其余藥劑均溶于甲醇中，分別 配成 1.0 × 104 mg/L 的母液，于 4 ℃ 黑暗條件下保 存，備用。試驗(yàn)時將上述藥劑母液加至無菌水 中，制成系列質(zhì)量濃度的藥液，其中鹽酸或甲醇 的體積分?jǐn)?shù)均小于 0.25% (此濃度的鹽酸或甲醇均 不影響煙草米根霉孢子的萌發(fā))。以在空白無菌水 中加入相同體積分?jǐn)?shù)稀鹽酸或甲醇的處理作為空 白對照。

85% 代森錳鋅可濕性粉劑 (WP)， 杜邦中國集團(tuán)有限公司；50% 多菌靈 WP，江蘇 藍(lán)豐生物化工股份有限公司；40% 嘧霉胺 WP， 北京中農(nóng)綠洲生物科技有限公司；250 g/L 嘧菌酯 懸浮劑 (SC，阿米西達(dá))，先正達(dá) (中國) 投資有限 公司；50% 啶酰菌胺水分散粒劑 (WDG，凱澤)，巴斯夫 (中國) 投資有限公司；500 g/L 氟啶胺懸浮 劑 (SC，福帥得)，日本石原產(chǎn)業(yè)株式會社。

采用孢子萌 發(fā)法測定。將米根霉菌株在 AEA 培養(yǎng)基上培養(yǎng) 5 d 后，菌絲表面產(chǎn)生大量黑色孢子，向培養(yǎng)皿中 加入 10 mL 無菌水，用無菌紗布過濾并收集孢 子，制得每毫升含 1 × 106 個孢子的懸浮液。分別 吸取 50 mL 各濃度藥液，與 50 mL 孢子懸浮液混 合，制得孢子混合液；以相同體積的無菌水和孢 子懸浮液混合后作為空白對照。孢子混合液中代 森錳鋅的最終測定質(zhì)量濃度為 0、3.13、6.25、 12.5、25 和 50 mg/L；多菌靈和嘧霉胺均為 0、 12.5、25、50 和 100 mg/L；嘧菌酯為 0、3.13、 6.25、12.5、25 和 50 mg/L；啶酰菌胺和氟啶胺均 為 0、0.13、0.25、0.50、1 和 2 mg/L。分別吸取 20 μL 孢子混合液至載玻片上，于保濕培養(yǎng)皿中、 30 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)，每處理 3 次重復(fù)。12 h 后隨機(jī)鏡檢孢子的萌發(fā)情況，當(dāng)萌發(fā)芽管長度超 過孢子半徑時視為萌發(fā)，計(jì)算各殺菌劑各濃度處 理對病原菌孢子萌發(fā)的抑制率。

將米根 霉菌株在 AEA 平板上培養(yǎng) 5 d 后，在菌落邊緣打 取直徑 5 mm 的菌碟。采用無菌水配制系列質(zhì)量 濃度的各制劑藥液，其中，代森錳鋅最終質(zhì)量濃 度 (有效成分) 分別為 0、160、800 和 4 000 mg/L， 多菌靈和嘧霉胺為 0、50、200 和 800 mg/L，嘧菌 酯為 0、12.5、50 和 250 mg/L，啶酰菌胺為 0、 37.5、125 和 200 mg/L，氟啶胺為 0、200、500 和 1 000 mg/L。采用手動噴霧器 (1.5 L，浙江濤桲 噴霧器有限公司) 向離體葉片正面均勻噴霧各濃度 藥液，直至藥液開始滴落，對照噴施同體積的無 菌水。施藥 24 h 后，用接種針在葉片主脈同一部 位制造相同尺寸傷口，接種直徑 5 mm 的菌碟， 每處理 6 片煙葉，3 次重復(fù)。接菌后用脫脂棉包裹 葉片莖基部保濕，置于 37 ℃、相對濕度大于 95% 的恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）中培養(yǎng)，48 h 后測量葉脈病斑長度，計(jì) 算各殺菌劑各濃度處理對煙葉霉?fàn)€病的防效。

按 1.2.1 節(jié) 方法制備每毫升含 1 × 106 個孢子的懸浮液，分別 采用以下方法進(jìn)行保存：1) 4 ℃ 保存；2) –20 ℃ 保存；3) 5 000 r/min 下離心 5 min 獲得孢子濕 樣，于 30 ℃ 烘干，孢子干樣于 4 ℃ 保存；4) 同上制備孢子干樣，于 –20 ℃ 保存；5) 將孢子懸浮 液置于 20% 甘油溶液中，于 4 ℃ 保存；6) 將孢子 懸浮液置于 20% 甘油溶液中，–20 ℃ 保存。60 d 后，從各保存樣品中吸取少量樣品，用無菌水分 別配制成濃度為每毫升含 1 × 106 個孢子的懸浮 液，參照 1.2.1 節(jié)的方法培育孢子，12 h 后調(diào)查孢 子的萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)各保存方法下米根霉孢子的 萌發(fā)率，以其新成熟孢子的萌發(fā)率為對照，評價 保存條件對孢子萌發(fā)的影響。

數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel 2010 軟件處理，以 藥劑質(zhì)量濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)、抑制率幾率值為 縱坐標(biāo)繪制毒力回歸曲線，計(jì)算毒力回歸方程及 有效抑制濃度 (EC50、EC90) 值。采用 DPS (7.05) 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

在測試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)， 供試 6 種殺菌劑對煙草米根霉孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出 了不同程度的抑制作用，其中，抑制活性最強(qiáng)的 是氟啶胺和啶酰菌胺，其 EC90 值分別為 0.67 和 1.53 mg/L；其次為代森錳鋅和嘧菌酯，最弱的為 嘧霉胺和多菌靈。測定結(jié)果表明，代森錳鋅、多菌靈、嘧霉 胺、嘧菌酯、啶酰菌胺和氟啶胺 6 種殺菌劑對煙 葉霉?fàn)€病的防治效果差異顯著 (P < 0.05)。施藥 24 h 后接種米根霉，代森錳鋅、多菌靈和嘧霉胺各濃 度處理組煙葉均有發(fā)病，3 種藥劑在最高質(zhì)量濃度 (4 000、800 和 800 mg/L) 下的防效均低于 20% (具體數(shù)據(jù)略)；嘧菌酯、啶酰菌胺和氟啶胺各濃度處 理均能抑制煙葉霉?fàn)€病的發(fā)生，且隨著藥劑質(zhì)量 濃度升高，防治效果均逐漸增強(qiáng)。其中嘧菌酯的 防效最好，50 mg/L 處理時可達(dá) 85%；其次為啶酰 菌胺，200 mg/L 處理的防效為 83%；氟啶胺的防 效相對較差，1 000 mg/L 處理時僅為 48%。保存前測得米根霉孢子 12 h 后的萌發(fā)率達(dá) 89%，經(jīng)過 6 種方法保存 60 d 后，萌發(fā)率均顯著 下降。其中，萌發(fā)率最高 (60%) 的為 4 ℃ 保存于 20% 甘油中的孢子懸浮液；其次分別為 4 ℃ 保存 的孢子干樣、4 ℃ 保存的孢子懸浮液及 –20 ℃ 保 存于 20% 甘油中的孢子懸浮液；而 –20 ℃ 保存的 孢子干樣和 –20 ℃ 保存的孢子懸浮液萌發(fā)率均較低。

作為重要的食品和工業(yè)微生物，米根霉的保 存方法已有諸多報(bào)道，然而，有關(guān)不同保存條 件對其孢子萌發(fā)的影響鮮有報(bào)道。本研究測定了米根霉在不同保存條件下存放 60 d 后孢子的萌發(fā) 活力，發(fā)現(xiàn)各種低溫保存方法均不同程度地降低 了孢子的萌發(fā)率。后續(xù)還將考查更多種保存條件 及不同保存時間等對米根霉孢子活力的影響。煙葉烘烤過程中變黃期的溫度和濕度尤其有 利于米根霉的侵染和產(chǎn)孢，同時由于烤房強(qiáng)力排 濕的需要，空氣流動速度高，十分有利于病原菌 的擴(kuò)散，因此在煙葉烘烤過程中米根霉可造成多 次侵染循環(huán)。但有關(guān)該病害的防治技術(shù)鮮有研 究報(bào)道，目前也沒有登記相關(guān)防治藥劑。筆者前 期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，農(nóng)藥經(jīng)銷商推薦給煙農(nóng)防治煙葉霉 爛病的藥劑有多菌靈、嘧霉胺和代森錳鋅等，這 些藥劑是否具有防治效果尚不清楚。