膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤， 據(jù)報(bào)道，中國(guó)腦膠質(zhì)瘤年發(fā)病率為 3～6 人/10 萬人，年死亡人數(shù)達(dá) 3 萬人。膠質(zhì)瘤為浸潤(rùn)性生長(zhǎng)， 和正常腦組織沒有明顯界限，難以完全切除，對(duì)放療、化療不甚敏感，非常容易復(fù)發(fā)，至今仍是全身 腫瘤中預(yù)后最差的腫瘤之一。將抗腫瘤藥物與引經(jīng) 藥聯(lián)合使用，增加治療藥物靶區(qū)的濃度，是提高腦 膠質(zhì)瘤治療效果的有效手段。

1 材料

1.1 藥品及試劑

TMZ，批號(hào) K19A9B58889，源葉生物科技有限 公司；VO，批號(hào) 20170614，其中總內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為 50.27%，藁本內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 30.67%，陜西昊 辰生物科技有限公司；聚山梨酯-80，Solarbio 公司； ECM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉 素雙抗，Sciencell 公司；Ham’s F-12K 培養(yǎng)基、馬 血清，美國(guó) Hyclone 公司；FBS，美國(guó) Gibco 公司； 胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、Hanks 緩沖液、 固體石蠟、樹膠、磷酸鹽緩沖液（PBS）、4×蛋白 上樣緩沖液、0.22 μm PVDF 膜、1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8、1 mol/L Tris-HCl pH 6.8、10×電轉(zhuǎn)液、5×Tris 甘氨酸電泳緩沖液、牛血清白蛋白（BSA）、20×TBS、 彩虹 245 plus 廣譜蛋白 Marker，Solarbio 公司；P-gp 抗體（Abcam 公司）；GAPDH 抗體、辣根酶標(biāo)記山 羊抗小鼠 IgG、HRP 辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG，北 京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；化學(xué)發(fā)光劑、BCA 試劑盒，天根生化科技有限公司；二甲苯、無水乙 醇、甲醛均為西隴科學(xué)股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器

AE31 倒置生物顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有 限公司；01220 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有 限公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安 泰空氣技術(shù)有限公司；Forma 3111 二氧化碳恒溫培 養(yǎng)箱，Thermo Electron 公司；3-18K 離心機(jī)，德國(guó) Sigma 公司；Agilent1260 高效液相色譜儀，美國(guó) Agilent 公司；多功能酶標(biāo)儀，Thermo 公司；冰箱， 青島海爾股份有限公司；腦立體定向儀，德國(guó) Kopf 公司；電動(dòng)牙科鉆，美國(guó) Foredom 公司；微量注射泵，美國(guó) KD Scientific 公司；RM2255 型包埋機(jī)、 EG1150H 型切片機(jī)、HI1210 型攤片機(jī)、HI1220 型 烘片機(jī)均為德國(guó)萊卡公司產(chǎn)品；BX43 型光學(xué)顯微 鏡，日本 Olympus 公司；A-35 型刀片，日本 Feather 公司；精宏DNP-9052 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn) 設(shè)備有限公司；GL-6250A 磁力攪拌器、TS-8 脫色 搖床，海門其林貝爾儀器制造有限公司；1645050 電泳電源、1658001 垂直電泳槽，BioRad 公司； Chemiscope 6000 Pro 熒光及化學(xué)發(fā)成像系統(tǒng)，上海 勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 細(xì)胞及動(dòng)物

大鼠 C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞，上海中喬新舟生物科技 有限公司；U87-MG 細(xì)胞，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù) 研究院；SPF 級(jí)雄性 Wistar 大鼠，體質(zhì)量 220～240 g，南京君科生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào) SCXK（滬）2013-0016，由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物中心按 SPF 級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)

2 方法

C6 細(xì)胞加入適量含有 15%馬血清、2.5% FBS 的 Ham’s F-12K 培養(yǎng)液，置于 37 ℃、5% CO2 的培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，常溫下經(jīng) 0.25%胰酶 消化，吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)置于離心管中，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)確定細(xì) 胞存活率，需存活率＞95%。離心管中剩余細(xì)胞以 1 000 r/min 離心 3 min，棄去上清液，調(diào)整細(xì)胞密度 為 7×107 個(gè)/mL 用于接種。U87-MG 細(xì)胞培養(yǎng)基為 含 10% FBS 的 DMEM，培養(yǎng)方法同 C6 細(xì)胞。大鼠接種 C6 細(xì)胞 2 周后，隨機(jī)抽取 5 只，取 瘤區(qū)腦組織做病理切片，判斷模型復(fù)制是否成功。 若鏡下見梭形細(xì)胞呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，細(xì)胞異型性明顯， 核分裂相易見，腫瘤微血管豐富，中心有明顯的出 血及柵欄狀壞死，表明造模成功。隨機(jī)將制備成功 的模型大鼠分為模型組（給予雙蒸水）、TMZ 組（25 mg/kg）、TMZ＋VO 低劑量組（TMZ/VO 2.5，25 mg/kg＋2.5 mg/kg）、TMZ＋VO 高劑量組（TMZ/VO 5，25 mg/kg＋5 mg/kg），每組 15 只，ig 給藥，連 續(xù)給藥 5 d，給藥體積為 10 mL/kg。各組大鼠給藥后 10%水合氯醛麻醉，仰臥位固 定，以橫膈肌處為起點(diǎn)，將胸部皮毛、肌肉組織剪 開，切開縱膈肌，將兩側(cè)肋骨剪斷，用止血鉗夾住 前胸肋骨劍突向上翻起，以便暴露心臟，用鑷子將 心臟固定，將灌注針從左心室插入主動(dòng)脈弓起始部， 用止血鉗固定心臟及針頭，剪開右心耳，先用 300 mL 37 ℃生理鹽水進(jìn)行快速灌注，再用 200 mL 4% 多聚甲醛固定液 20 min 內(nèi)勻速灌注。灌注完畢后， 開顱，將腦組織完整取出，在 4%多聚甲醛溶液內(nèi) 固定 1 周。將腫瘤組織從腦內(nèi)完整的剝離取出，稱 質(zhì)量，并測(cè)量腫瘤短徑（a）和長(zhǎng)徑（b），計(jì)算腫瘤 體積（V）及腫瘤體積抑制率，腫瘤體積抑制率＞ 30%，表明腫瘤對(duì)藥物敏感。

3 結(jié)果

造模前各組大鼠體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué) 差異，造模后當(dāng)天給予充足飼料，第 2 天觀察大鼠 已開始自行覓食、飲水。術(shù)后大鼠食物和水的攝入 較術(shù)前均有減少。模型組大鼠術(shù)后出現(xiàn)精神狀態(tài)萎 靡不振，毛發(fā)不整潔、黯淡無光，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng) 量減少，聚集成堆等表現(xiàn)，個(gè)別伴有腹瀉等癥狀， 體質(zhì)量下降明顯；7～14 d 大鼠暴躁易怒，攻擊力增 強(qiáng)，多數(shù)有明顯的腦部腫起，部分出現(xiàn)眼眶周圍出 血、鼻出血、偏癱等顱內(nèi)高壓的癥狀。TMZ、TMZ/VO 2.5 和 TMZ/VO 5 組大鼠術(shù)后 14 d 內(nèi)精神狀態(tài)及顱 內(nèi)高壓癥狀表現(xiàn)與模型組相同，連續(xù)給藥 5 d 后， 部分大鼠頭部的腫起逐漸消失，毛發(fā)光澤度較模型 組光亮；14 d 后給藥組大鼠體質(zhì)量有緩慢上升的趨 勢(shì)，TMZ/VO 2.5 和 TMZ/VO 5 組大鼠給藥后體質(zhì) 量比模型組及 TMZ 組大鼠上升更快，與模型組比 較差異顯著（P＜0.05）。

4 討論

腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)惡性原發(fā)性腦腫瘤，致死率高，由于其浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，和正常腦組織沒有 明顯界限，手術(shù)難完全切除，對(duì)放療、化療不甚敏 感，因此腦膠質(zhì)瘤至今仍是全身腫瘤中預(yù)后最差的 腫瘤之一。研究者利用腫瘤表面特異性高表達(dá)的受 體作為藥物遞送系統(tǒng)作用靶點(diǎn)構(gòu)建一級(jí)靶向給 藥系統(tǒng)，以及在一級(jí)靶向的基礎(chǔ)上增加腦靶向的二級(jí)靶向。



 

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