百草枯（paraquat，PQ）是目前最為廣泛的應 用除草劑之一。PQ 對人畜具有非常強的毒性，PQ 急性中毒死亡率高達 50%~80%。PQ 常用于自殺、 投毒，是臨床和司法檢驗中較常見的毒物。百草枯 中毒機制十分復雜，研究發現，除了百草枯本身的 理化作用外，還有大量炎性因子和細胞因子參與作 用。目前 PQ 中毒機制的主流因素為氧化損傷，即活性氧簇（ROS）可直接損傷肺、腎、肝等器官。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑 

氣相色譜 7890B（美國安捷倫公司）、質譜儀 PEGASUS HT（美國 LECO 公司）、離心機 Heraeus Fresco 17（美國賽默飛科技公司）、超低溫冰箱 Forma 900 series（美國賽默飛科技公司）、超聲儀（寧 波新芝科技有限公司）、烘箱、真空干燥儀（上海精宏實驗設備公司）。甲醇（色譜純，CNW 科技公司）、 吡啶（色譜純，Adamas 試劑公司）、甲氧銨鹽（分 析純，TCI 試劑公司），L-2- 氯苯丙氨酸（≥ 98%， 上海恒柏生物科技）、BSTFA（with 1%TMCS,v/v） （Regis 科技公司）。 

1.2 動物實驗 

動物為昆明小鼠（沈陽長生生物技術有限公司 提供）10 只雌鼠，8 周齡，自由飲水、進食，適應 性喂養 1 周。隨機分為空白對照組和百草枯中毒模 型組共 2 組，每組 5 只小鼠。取 5 只小鼠，灌胃百 草枯劑量為 30 mg/kg。空白對照組腹腔注射同等劑 量的生理鹽水溶液。24h 后處死動物，取心血 0.3 mL，4℃下 15000 r/min 離心 10 min，取上清置于 1.5mLPE 管，置于 -80℃冰箱凍存。 

1.3 GC-MS 樣品預處理

取50μL樣本于1.5mL EP管中，加入200μL甲醇， 再加入 5μL L-2- 氯苯丙氨酸（溶于超純水中 0.5mg/ mL），渦旋 30s 混勻；將樣本 4℃離心，12000rpm 離心 15min；小心移取 200μL 上清液于 1.5mL EP 管 中；在真空濃縮器中干燥提取物；向干燥后的代謝物 加入 30μL 甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶 20mg/mL），輕輕混勻后，放入烘箱中 80℃孵育 30min；向每個樣品中加入 40μL BSTFA（含有 1% TMCS, v/v），將混合物 70℃孵育 1.5h，上機檢測。 

1.4 儀器條件 

Agilent7890 GC-TOF-MS，色譜柱 DB-5MS（30 m×250μm×0.25μm），程序升溫：初始溫度 50℃保 持 1min，以 20℃ /min 的升溫速率升至 310℃，保 持 6min。進樣口溫度 280℃，傳輸線溫度 280℃， 離子源溫度 250℃，電離電壓 70 ev，質量范圍 m/z 50-500 amu，氦氣流速為 1ml/min，分流比（1:20） 進樣。 

1.5 數據處理 

使 用 ChromaTOF 軟 件（V 4.3x，LECO） 對 質譜數據進行了峰提取、基線矯正、解卷積、峰 積分、峰對齊等分析。對物質定性工作中，使 用了 LECO-Fiehn Rtx5 數據庫，包括質譜匹配及 保留時間指數匹配。采用主成分分析（principle component analysis, PCA）觀察各組樣本之間的 整體分布狀況。采用多維分析方法正交偏最小 二乘法判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）方法用來評價 模型的準確性，選取變量重要性投影（the variable importance in the projection，VIP）值＞ 1 的差異 代謝物。本研究同時采用學生 t 檢驗，選定 P ＜ 0.05 為有顯著性差異。

2 結果 

2.1 血清代謝組學分析 

PQ 中毒模型組與對照組的血液樣本經過硅烷化 衍生、GC-MS 檢測，得到 GC-MS 總離子流色譜圖， 本次實驗共檢出 591 個峰。為得到明確的代謝物的差異信息，需要 應用統計學進一步處理數據。 通過對對照組、PQ 中毒組小鼠血清中代謝物 質進行 PCA 分析，發現：PQ 中毒組 與對照組無交叉重疊，具有明顯的分離趨勢，說 明這兩組間小鼠血清代謝物發生了明顯的變化。 圖 2b 中橫坐標 tP 表示第一主成分的預測主成 分得分，縱坐標 tO 表示正交主成分得分，散 點形狀和顏色表示不同的實驗分組。從 OPLSDA 得分圖的結果可以看出，兩組樣本區分非常 顯著，樣本全部處于 95% 置信區間（Hotelling’s T-squaredellipse）內。

2.2 潛在生物標志物的確定 

本次實驗檢出了 591 個峰，采用 OPLS-DA 模 型第一主成分的 VIP（Variable Importance in the Projection）值（閾值＞ 1），并結合學生 t 檢驗（t-test） 的 p 值（閾值≤ 0.05）來尋找差異性表達代謝物。 本研究將篩選差異代謝物的結果以火山圖（volcano plot）的形式進行可視化，PQ 中毒模型對對照組的 結果如圖 3 所示，火山圖中每個點代表一個代謝物，橫坐標代表該組對比各物質的倍數變化（取以 2 為 底的對數），縱坐標表示學生 t 檢驗的 P 值（取以 10 為底對數的負數），散點大小代表 OPLS-DA 模型 的 VIP 值，散點越大 VIP 值越大，散點顏色代表最 終的篩選結果，顯著上調的代謝物以紅色表示，顯 著下調的代謝物以藍色表示，非差異性的代謝物為 灰色。

3 討論 

百草枯中毒后會累及多器官損傷，靶器官是肺 臟，經肺臟攝取百草枯后發生氧化還原反應，會干 擾線粒體電子傳遞，產生大量氧自由基，誘發脂質過氧化損傷，導致線粒體功能障礙。線粒體是細胞 的“發電廠”，它參與了三羧酸循環和呼吸鏈的傳遞。本次研究發現模型組中檸檬酸含量顯著增加， 檸檬酸是三羧酸（TCA）循環的中間產物，表明 TCA 循環受阻，底物消耗減少，進而會影響能量供應?？傊琍Q 中毒干擾 TCA 循環，表現為檸檬酸、 琥珀酸和富馬酸的含量增加。

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